Jhonny memulai karier di Polri pada 1996. Dia tercatat pernah menduduki berbagai posisi penting di berbagai satuan dan wilayah.
Pada 1998, dia menjabat sebagai Kasat Serse Polres Maliana Timor Timur, lalu dilanjutkan dengan posisi sebagai Kasat Sabhara Polres Dili dan KBO Serse Polres Surabaya Utara Polda Jawa Timur (Jatim) pada 1999.
Selama bertahun-tahun, Jhonny menempati sejumlah posisi strategis, seperti Kapolsek Karangpilang Polres Surabaya Selatan pada 2003, Kanit I Sat II Ekonomi Ditreskrim Polda Jatim pada 2007, serta Wakapolres Surabaya Selatan Polda Jatim pada 2009.
Setahun setelahnya, dia dipercaya untuk menduduki posisi Kanit II Sat I Pidum Ditreskrim Polda Jatim, dan pada 2011 ia menjabat sebagai Kanit I Subdit II Hardabangta Ditreskrimum Polda Jatim.
Pada 2012, Jhonny kembali ke Papua dan menduduki posisi Kasubdit III Tipikor Ditreskrimsus Polda Papua. Kariernya terus menanjak, dengan penugasan sebagai Kapolres Jayawijaya pada 2013, Kapolres Manokwari pada 2014, hingga Wadirreskrimum Polda Banten pada 2016.
Dia juga pernah menjadi Dosen Utama STIK PTIK serta Dirreskrimsus Polda Riau pada 2017.
Pada tahun yang sama, Jhonny mendapat tugas penting sebagai Ajudan Presiden ke-7 RI Joko Widodo (Jokowi), posisi yang diemban selama hampir dua tahun hingga 2019. Usai meninggalkan posisi tersebut, karier Jhonny terus berkembang pesat.
Pada 2019, dia menduduki tiga jabatan sekaligus yakni sebagai Irbidjemensdm II Itwil V Itwasum Polri, Analis Kebijakan Madya Bidang Binkar SSDM Polri, serta Kapolrestabes Medan.
Karier Jhonny semakin menanjak saat dipercaya menjadi Kapolrestabes Surabaya pada 2020. Setahun setelahnya, dia dipromosikan menjadi Wakapolda Sulawesi Utara.
Di akhir 2023, Jhonny dilantik sebagai Kapolda Papua Barat menggantikan Irjen Daniel Tahi Monang Silitonga.
Selain itu, Jhonny Edison Isir juga memiliki pengalaman dalam berbagai penugasan penting, seperti menjadi Satgas BBM Ilegal Batam pada 2005, Satgas Bareskrim Polri pada 2021, serta Kasatgas Antikorupsi Polda Papua pada 2013.