Bahkan dia berkeinginan agar wilayah Demak melepaskan diri dari kekuasaan Mataram. Alhasil pada 1602 Masehi terjadilah perang saudara, antara Demak melawan Mataram. Perang saudara antara Mataram melawan Demak ini berlangsung sekitar 3 tahun.
Pada perang ini, Pangeran Puger didukung Adipati Gending serta Adipati Panjer. Pangeran Puger menuntut daerah Demak hingga ke Tambak Uwos, Jawa Timur sebagai kerajaan sendiri. Agaknya upaya Pangeran Puger ini dalam rangka untuk mengembalikan kejayaan Demak serta Dinasti Majapahit. Tetapi usahanya tidak tercapai.
Panembahan Hanyakrawati mengakhiri perlawanan pemberontakan oleh kakak tirinya dengan mengirimkan Tumenggung Suranata atau Ki Gede Mestaka pada 1605 Masehi untuk memadamkan pemberontakan. Peperangan pun dimenangkan oleh Mataram.
Pada 1605, Pangeran Puger berhasil ditangkap dan diasingkan ke Kudus. Putra Pangeran Puger kemudian diangkat sebagai Adipati Pati yang bergelar Adipati Pragola. Kelak adipati inilah yang juga melakukan pemberontakan ke Mataram, yang dikenal dengan pemberontakan Pragola II.