Pasteur ingin menerapkan prinsip vaksinasi pada antraks. Dia mempersiapkan cultures of the bacillus setelah menentukan kondisi yang menyebabkan hilangnya virulensi organisme.
Pada musim semi 1881 dia memperoleh dukungan keungan, kebanyakan dari petani, untuk melakukan percobaan publik besar-besaran dari imunisasi antraks. Percobaan berlangsung di Pouilly-le-Fort, yang terletak di pinggiran selatan Paris.
Pasteur mengimunisasi 70 hewan ternak dan percobaan tersebut sukses besar. Prosedur vaksinasi melibatkan dua inokulasi pada interval 12 hari dengan vaksin dari berbagai potensi.
Satu vaksi, dari kultur virulensi rendah, diberikan kepada separuh domba dan diikuti oleh yang kedua dari kultur yang lebih ganas dibanding yang pertama. Dua minggu kemudian setelah inokulasi awal ini, domba yang divaksinasi dan kontrol diinokulasi dengan strain antraks yang ganas.
Dalam beberapa hari semua domba kontrol mati, sedangkan semua hewan yang divaksinasi selamat. Hal ini meyakinkan banyak orang karya Pasteur memang valid.
Menyusul keberhasilan percobaan vaksinasi antraks, Pasteur berfokus pada asal mikroba penyakit. Investasinya terhadap hewan yang terinfeksi oleh mikroba patogen dan studinya tentang mekanisme mikroba yang menyebabkan efek fisiologis berbahaya pada hewan membuatnya menjadi pelopor dalam bidang infectious pathology.
Sukses melawan penyakit antraks, Pasteur memutuskan untuk mengembangkan vaksin lain. Vaksi pertama melawan rabies. Dia memutuskan melawan rabies pada 1882.